Polimerase adalah

Dari semua fungsi enzimatik yang diperlukan untuk replikasi DNA, kemampuan untuk mengkatalisasi penggabungan deoksinukleotida ke dalam DNA adalah yang paling utama. Enzim yang mengkatalisasi reaksi ini, DNA polimerase, telah diisolasi dari banyak spesies, dan banyak spesies memiliki banyak DNA polimerase.

Pemahaman kita yang paling awal dan paling lengkap tentang mekanisme enzim ini berasal dari studi DNA polimerase pertama yang diisolasi, yang disebut DNA polimerase I.

Pengertian

Polimerase adalah enzim yang mengkatalisis sintesis DNA atau polimer RNA yang urutannya saling melengkapi dengan templat asli, seperti yang didefinisikan oleh pasangan basa Watson-Crick.

Mekanisme penambahan nukleotida oleh DNA polimerase

Pada tahun 1956 Arthur Kornberg dan rekan kerjanya mengisolasi protein dari E. colithat memiliki banyak sifat yang diharapkan untuk DNA polimerase yang digunakan dalam replikasi. Secara khusus, ini mengkatalisasi sintesis DNA dari deoxynucleotide, itu membutuhkan template dan mensintesis pelengkap template.

Ini adalah rantai polipeptida tunggal dari 928 asam amino, dan itu adalah produk dari polAgene. Kita sekarang mengerti bahwa ini adalah polimerase yang melimpah, tetapi alih-alih mensintesis DNA baru pada garpu replikasi, ini digunakan selama proses penggabungan fragmen Okazaki setelah sintesis dan dalam perbaikan DNA.

Studi terperinci tentang DNA polimerase I sangat berharga bagi pemahaman kita tentang mekanisme polimerisasi. Meskipun DNA polimerase I bukan merupakan polimerase replikasi pada E. coli, enzim homolog digunakan dalam replikasi pada spesies lain. Juga, kisah tentang bagaimana polimerase DNA replikatif terdeteksi dalam E. coli adalah ilustrasi klasik tentang kekuatan menggabungkan biokimia dan genetika untuk mencapai pemahaman yang lebih lengkap tentang proses seluler yang penting.

DNA polimerase I mengkatalisasi polimerisasi dNTPs menjadi DNA. Hal ini terjadi dengan penambahan dNTP (sebagai dNMP) ke ujung 3 ‘dari rantai DNA, maka pertumbuhan rantai terjadi dalam arah 5’ ke 3 ‘(Gambar 5.11).

Dalam reaksi ini, hidroksil 3 ‘pada ujung rantai yang sedang tumbuh adalah nukleofil, menyerang atom fosfor dalam a-fosfat dNTP yang masuk. Reaksi berlangsung dengan membentuk fosfoester antara ujung 3 ‘rantai tumbuh dan fosfat 5’ dari nukleotida yang masuk, membentuk ikatan fosfodiester dengan nukleotida baru dan membebaskan pirofosfat (disingkat PPi).

Jadi dalam reaksi ini, ikatan fosfanhidrida dalam dNTP terputus, dan fosfodiester terbentuk. Perubahan energi bebas untuk memutuskan dan membentuk ikatan kovalen ini sedikit tidak menguntungkan untuk reaksi seperti yang ditunjukkan.

Namun, interaksi nonkovalen tambahan, seperti ikatan hidrogen nukleotida baru dengan nukleotida komplementer dan interaksi penumpukan basa dengan nukleotida tetangga, berkontribusi untuk membuat perubahan energi bebas total yang mendukung reaksi dalam arah sintetis.

Namun demikian, pada pirofosfat konsentrasi tinggi, reaksi dapat dibalik. Pada reaksi dalam arah sebaliknya, nukleotida secara progresif dihilangkan dan dilepaskan sebagai dNTP dalam reaksi pyrophosphorolysis. Ini tidak mungkin memiliki signifikansi fisiologis yang besar, karena pirofosfatase yang ada di mana-mana mengkatalisis hidrolisis pirofosfat menjadi molekul fosfat.

Reaksi terakhir ini sangat disukai secara termodinamika dalam arah hidrolisis. Jadi, reaksi gabungan penambahan nukleotida baru ke rantai DNA yang tumbuh dan hidrolisis pirofosfat memastikan bahwa keseluruhan reaksi mendukung sintesis DNA. Kimia dasar penambahan nukleotida ke rantai polinukleotida tumbuh yang diuraikan dalam Gambar 5.11 adalah umum untuk hampir semua DNA dan RNA polimerase.

Reaksi sintesis DNA yang dikatalisis oleh DNA polimerase I membutuhkan Mg2 +, yang merupakan kofaktor untuk katalisis, dan empat deoksinukleosida trifosfat (dNTPs), yang merupakan blok bangunan monomer untuk polimer yang sedang tumbuh. Reaksi ini juga membutuhkan untai templat DNA untuk mengarahkan sintesis untai baru, seperti yang diprediksi oleh model heliks ganda untuk DNA dan dikonfirmasi oleh percobaan Meselson dan Stahl.

Reaksi ini juga membutuhkan primer, yang merupakan molekul (biasanya rantai DNA atau RNA) yang menyediakan hidroksil 3 ‘yang ditambahkan nukleotida yang masuk. DNA polimerase tidak dapat memulai sintesis pada suatu templat dengan hanya menggabungkan dua nukleotida.

Sebaliknya, mereka mengkatalisasi penambahan dNTP ke rantai nukleotida yang sudah ada sebelumnya; rantai yang sebelumnya disintesis ini adalah primer. Primer saling melengkapi dengan templat, dan ujung 3 ‘primer mengikat ke enzim di situs aktif untuk polimerisasi (Gambar 5.12).

Ketika rantai DNA baru dibuat, setelah nukleotida baru telah ditambahkan ke rantai yang sedang tumbuh, hidroksil 3’-nya sekarang menjadi ujung primer. Polimerase bergerak maju satu nukleotida sehingga ujung primer baru ini berada di lokasi aktif untuk polimerisasi.

Pandangan alternatif, bahwa templat-primer DNA bergerak sementara DNA polimerase tetap, juga dimungkinkan. Dalam kedua kasus, nukleotida terakhir yang ditambahkan sekarang merupakan ujung primer 3 ‘, dan nukleotida berikutnya pada cetakan siap untuk mengikat langsung nukleosida trifosfat lain.

Untuk sintesis awal awal rantai DNA baru, primer harus dihasilkan oleh enzim yang berbeda; ini akan dibahas secara lebih rinci nanti dalam bab ini. Misalnya, oligoribonukleotida pendek adalah primer untuk fragmen Okazaki; ini ditemukan di ujung 5 ‘dari fragmen Okazaki dan dibuat oleh enzim yang disebut primase. Primer RNA dihilangkan dan diganti dengan DNA (oleh DNA polimerase I) sebelum ligasi.

Situs aktif polimerisasi untuk DNA polimerase I memiliki situs pengikatan dNTP spesifik (Gambar 5.12), dan situs aktif menyesuaikan dengan deoksinukleotida pada untai cetakan untuk mendukung pengikatan deoksinukleotida komplementer pada situs aktif. Jadi, polimerase mengkatalisasi penambahan pada rantai yang tumbuh dari deoksinukleotida yang saling melengkapi dengan deoksinukleotida dalam untai cetakan.

Dalam reaksi yang dikatalisis oleh DNA polimerase I, dan semua polimerase DNA lain yang dipelajari, deoksinukleotida yang masuk diaktifkan. Ikatan phosphoanhydride dalam bentuk trifosfat deoksinukleotida adalah ikatan berenergi tinggi (yaitu, mereka memiliki negatif, atau disukai, energi bebas hidrolisis), dan b- dan g-fosfat membuat kelompok yang baik (seperti pirofosfat) setelah serangan nukleofilik.

Sebaliknya, ujung rantai DNA yang tumbuh tidak diaktifkan; ini adalah 3’-hidroksil sederhana pada deoksinukleotida terakhir yang ditambahkan. Penambahan monomer teraktivasi ini ke polimer tumbuh yang tidak aktif disebut mekanisme pertumbuhan-ekor. DNA polimerase menggunakan mekanisme ini hanya dapat mensintesis dalam arah 5 ‘sampai 3’, dan semua

DNA dan RNA polimerase yang dikenal melakukan ini. Beberapa makromolekul lain, seperti protein, dibuat oleh mekanisme pertumbuhan kepala. Dalam hal ini, ujung monomer yang tidak diaktifkan menyerang ujung polimer yang diaktifkan. Rantai memanjang lagi berisi kepala yang diaktifkan (dari monomer terakhir ditambahkan).

Fungsi Polimerase

Replikasi DNA genomik adalah fungsi utama DNA polimerase. Setelah DNA diduplikasi secara akurat, sel dapat menjalani pembelahan dengan setiap sel anak menerima kode genetik lengkap dari organisme.

Polimerase yang bertanggung jawab untuk fungsi replikasi DNA adalah mesin multiprotein kompleks yang dapat mensintesis DNA dengan kecepatan tinggi, proses, dan kesetiaan. Misalnya, dalam E. coli, holoenzim DNA polimerase III mensintesis DNA pada sekitar 750 nukleotida per detik, dan dapat memperpanjang untai DNA untuk beberapa ribu nukleotida tanpa memisahkan dari template.

Beberapa aksesori protein pada DNA polimerase membentuk partikel holoenzyme dan menyediakan aktivitas yang penting untuk replikasi DNA yang cepat dan akurat. Partikel holoenzyme mengandung dua salinan dari polimerase yang mengoordinasikan sintesis DNA untai terkemuka dan tertinggal.

Setiap polimerase dikaitkan dengan penjepit protein berbentuk cincin yang mengelilingi DNA dan menambatkan polimerase ke dupleks, memungkinkan polimerase mereplikasi beberapa ribu nukleotida secara proaktif. Holoenzyme juga mengandung kompleks protein clamp loader yang merakit klem melingkar di sekitar DNA untuk digunakan oleh DNA polimerase.

Serupa dengan holoenzim E. coli polimerase III, polimerase replikatif dari organisme lain, termasuk manusia, juga menggunakan protein aksesori seperti klem bundar untuk memastikan replikasi DNA prosesif dan cepat. Aktivitas exonuclease 3 ′ → 5 is juga dikaitkan dengan polimerase III dan memungkinkan holoenzyme untuk mengoreksi DNA yang baru disintesis dan memperbaiki kesalahan dalam replikasi saat mereka terjadi.

Aktivitas proofreading seperti itu biasanya dikaitkan dengan DNA polimerase, baik dalam bentuk protein yang terpisah atau sebagai bagian dari protein polimerase itu sendiri, seperti yang terlihat pada T7 DNA polimerase (Gambar 1).

Polymerase bertanggung jawab untuk fungsi perbaikan DNA dengan mengganti DNA yang rusak dengan untai yang baru disintesis untuk memperbaiki cacat. E. coli DNA polimerase I memainkan peran penting dalam perbaikan eksisi DNA dengan mengisi celah beruntai tunggal yang tersisa dalam DNA, setelah penghapusan DNA yang rusak oleh mesin eksisi.

Peran penting dari polimerase dalam perbaikan DNA diilustrasikan oleh fakta bahwa sel-sel yang mengandung bentuk DNA polimerase I yang tidak aktif sangat sensitif terhadap efek merusak sinar UV dan sinar-X serta bahan kimia mutagenik.



Leave a Reply