Setiap pendatang baru yang bergabung dengan laboratorium biologi molekuler tidak diragukan lagi akan diminta untuk merancang, memodifikasi, atau membuat plasmid.
Plasmid adalah potongan DNA bundar kecil yang ditemukan dalam sel bakteri, dan seseorang yang baru menggunakan plasmid mungkin memerlukan panduan tambahan untuk memahami komponen spesifik yang membentuk plasmid dan mengapa masing-masing penting.
Apa itu plasmid?
Plasmid adalah fragmen dari DNA beruntai ganda yang dapat mereplikasi secara independen dari DNA kromosom, dan biasanya membawa gen.
Apa artinya plasmid? Semua informasi harus dibawa atau disampaikan melalui media tertentu. Informasi digital dibawa secara elektronik, kumpulan miliaran atau triliunan sakelar kecil yang terorganisir yang dapat berada di dua posisi berbeda (hidup atau mati / 1 atau 0).
Informasi tertulis disampaikan melalui bahasa dan sintaksis, pengaturan berbeda dari rangkaian karakter universal yang dimaksudkan untuk menyampaikan pemikiran atau konsep tertentu.
Seperti bentuk-bentuk informasi lainnya, informasi genetik juga harus diekspresikan melalui medium, dan medium itu adalah gen. Gen adalah unit fungsional terkecil dari pewarisan, dan tersusun dari sekuens DNA untai ganda linier yang membawa cetak biru untuk setiap sifat fenotipik yang diwariskan yang berbeda.
Pengertian plasmid,
Pada tingkat paling dasar, plasmid adalah potongan kecil DNA yang bereplikasi secara independen dari DNA kromosom inang. Mereka terutama ditemukan dalam bakteri, tetapi juga ada secara alami di archaea dan eukariota seperti ragi dan tumbuhan.
Secara alami, plasmid memberikan satu atau lebih manfaat fungsional bagi inang seperti resistensi terhadap antibiotik, fungsi degradatif, dan / atau virulensi.
Semua plasmid alami mengandung asal replikasi (yang mengontrol kisaran inang dan jumlah salinan plasmid) dan biasanya termasuk gen yang menguntungkan untuk bertahan hidup, seperti gen resistensi antibiotik.
Sebaliknya, plasmid yang digunakan di lab biasanya buatan dan dirancang untuk memasukkan DNA asing ke sel lain.
Minimal, plasmid yang dibuat di laboratorium memiliki asal replikasi, penanda seleksi, dan situs kloning. Kemudahan memodifikasi plasmid dan kemampuan plasmid untuk mereplikasi diri sendiri dalam sel menjadikannya alat yang menarik bagi ilmuwan kehidupan atau ahli biologi.
Definisi Plasmid,
Pada dasarnya, plasmid adalah molekul DNA kecil yang dapat direplikasi secara independen. Dengan demikian, plasmid tidak bergantung pada DNA kromosom organisme untuk replikasi. Karena karakteristik ini, plasmid juga disebut sebagai DNA ekstra-kromosom.
Meskipun molekul plasmid ini pertama kali ditemukan pada anggota Enterobacteriacae, penelitian telah menunjukkan bahwa plasmid secara alami terjadi di banyak jenis mikroorganisme di seluruh dunia.
Meskipun telah ada perdebatan mengenai apakah plasmid dapat dianggap sebagai mikroorganisme, setidaknya menggunakan definisi virus yang diusulkan, perlu dicatat bahwa istilah “plasmid” sebagian besar digunakan untuk merujuk pada elemen genetik yang ada di luar kromosom (dalam DNA). organisme) dan mampu mereplikasi secara mandiri.
Ciri-ciri Plasmid,
- Asal Replikasi (ORI). Urutan DNA yang memungkinkan inisiasi replikasi dalam plasmid dengan merekrut protein mesin transkripsi
- Gen Perlawanan Antibiotik. Memungkinkan pemilihan bakteri yang mengandung plasmid.
- Multiple Cloning Site (MCS). Segmen pendek DNA yang berisi beberapa situs restriksi memungkinkan penyisipan DNA yang mudah. Dalam ekspresi plasmid, MCS seringkali hilir dari promotor.
- Gen, promotor atau fragmen DNA lainnya diklon ke MCS untuk studi lebih lanjut.
- Wilayah Promotor. Mendorong transkripsi gen target. Komponen vital untuk vektor ekspresi: menentukan jenis sel gen mana yang diekspresikan dan jumlah protein rekombinan yang diperoleh.
- Marker yang Dapat Dipilih. Gen resistensi antibiotik memungkinkan untuk seleksi pada bakteri. Namun, banyak plasmid juga memiliki penanda yang dapat dipilih untuk digunakan dalam jenis sel lainnya.
- Situs Pengikat Primer. Urutan DNA untai tunggal pendek yang digunakan sebagai titik inisiasi untuk amplifikasi atau sekuensing PCR. Primer dapat dieksploitasi untuk verifikasi urutan plasmid.
Daftar Elemen Vektor plasmid di atas menguraikan ciri-ciri umum yang dapat direkayasa dari plasmid.
Struktur plasmid,
Sehubungan dengan struktur, plasmid terbuat dari rantai ganda melingkar DNA. Struktur bundar plasmid dimungkinkan oleh dua ujung untai ganda yang bergabung dengan ikatan kovalen.
Ukuran molekul plasmid juga kecil, terutama jika dibandingkan dengan DNA organisme, dan mengukur antara beberapa kilobasa dan beberapa ratus kilobasa.
Meskipun sejumlah besar plasmid memiliki struktur lingkaran tertutup kovalen, beberapa plasmid memiliki struktur linier dan tidak membentuk bentuk lingkaran.
Komponen Plasmid,
Secara umum, plasmid terdiri dari tiga komponen utama yang meliputi:
- Asal replikasi (replicon) – Asal usul replikasi (ori) mengacu pada lokasi spesifik di untai di mana replikasi dimulai. Untuk plasmid, lokasi ini sebagian besar terdiri dari pasangan basa A-T yang lebih mudah dipisahkan selama replikasi.
- Dibandingkan dengan DNA organisme yang terdiri dari banyak asal replikasi, plasmid memiliki satu dari beberapa asal replikasi karena ukurannya lebih kecil. Pada asal replikasi, plasmid juga mengandung sejumlah elemen pengatur yang berkontribusi pada proses (mis. Protein Rep)
- Polilinker (beberapa situs kloning) – Dalam plasmid, polylinker (MCS) adalah salah satu bagian terpenting dari molekul. Ini karena memungkinkan siswa untuk belajar lebih banyak tentang kloning. Pada dasarnya, plasmid polilinker adalah urutan pendek DNA yang terdiri dari beberapa situs untuk pembelahan oleh enzim restriksi. Dengan demikian, plasmid ini memungkinkan penyisipan DNA yang mudah melalui ligasi atau restriksi enzim restriksi. Di lokasi belahan dada, polylinker yang berbeda dapat memotong untai. Oleh karena itu, salah satu enzim restriksi dapat memotong plasmid pada titik yang diberikan oleh sang pejantan untuk memungkinkan penyisipan DNA.
- Gen resistensi antibiotik – Gen resistensi antibiotik adalah salah satu komponen utama plasmid. Gen-gen ini memainkan peran penting dalam resistensi obat (terhadap satu atau lebih antibiotik) sehingga membuat pengobatan beberapa penyakit lebih menantang.
Plasmid saat ini dikenal karena kemampuannya untuk mentransfer dari satu spesies bakteri ke spesies lain melalui proses yang dikenal sebagai konjugasi (kontak antar sel yang diikuti oleh transfer konten DNA). Dalam prosesnya, mereka mampu memberikan sifat resistensi antibiotik kepada spesies bakteri lain.
Sementara replikasi plasmid memberikan keuntungan tambahan bagi bakteri (resistensi terhadap antibiotik tertentu), plasmid juga mempengaruhi pembelahan sel bakteri karena beban replikasi tambahan. Akibatnya, bakteri dengan plasmid cenderung dihuni oleh mereka yang tanpa plasmid karena berkurangnya pembelahan sel.
Beberapa komponen lain dari plasmid termasuk:
- Wilayah promotor – Ini adalah komponen plasmid yang terlibat dalam merekrut mesin transkripsi.
- Situs pengikatan primer – Kompoen plasmid ini adalah sekuens pendek DNA pada untai tunggal yang biasanya digunakan untuk keperluan amplifikasi PCR atau sekuensing DNA
Meskipun plasmid memiliki berbagai karakteristik umum, ada beberapa jenis yang berbeda.
Jenis dan Fungsi Plasmid,
Plasmid resistan
Juga disebut sebagai plasmid resistensi antimikroba, resistensi plasmid adalah jenis plasmid yang membawa gen yang memainkan peran penting dalam resistensi antibiotik. Plasmid ini juga sangat terlibat dalam konjugasi bakteri dengan memproduksi pili konjugasi yang mentransfer R plasmid dari satu bakteri ke bakteri lain.
Plasmid resistan dibagi menjadi dua kelompok utama yang meliputi:
- Kelompok kisaran inang sempit – Seringkali direplikasi dalam satu spesies tunggal.
- Kelompok jangkauan inang luas – Mudah dipindahkan di antara spesies bakteri.
Kelompok plasmid yang resistan ini terbukti membawa sejumlah gen resistensi antibiotik. Setelah transfer gen resistensi antibiotik ke bakteri yang peka terhadap obat, ini dapat menyebabkan bakteri mengembangkan resistensi terhadap berbagai obat.
Plasmid Degradatif
Dibandingkan dengan jenis plasmid lainnya, plasmid degradatif memungkinkan organisme inang untuk mendegradasi / memecah senyawa xenobiotik.
Juga disebut sebagai zat bandel, senyawa xenobiotik mencakup berbagai senyawa yang dilepaskan ke lingkungan sebagai akibat dari tindakan manusia dan karenanya tidak terjadi secara alami atau umum di alam.
Inang plasmid degradatif ditemukan dalam kelompok IncP-1, IncP-7, dan IncP-9 dan termasuk spesies seperti Ochrobactrum anthropi, Rhizobium sp, Burkholderia hospita, Escherichia coli, dan Pseudomonas fluorescens.
Karena kemampuan inang untuk mendegradasi senyawa xenobiotik, para peneliti telah mencoba menggunakan plasmid untuk mendegradasi berbagai zat yang terkontaminasi di lingkungan.
Namun, mengingat ini belum terbukti efektif, studi penelitian terus dilakukan untuk menentukan bagaimana menggunakan berbagai bakteri asli (sebagai inang plasmid degradatif) untuk degradasi senyawa tersebut.
Sementara plasmid degradatif berkontribusi terhadap degradasi senyawa xenobiotik, perilaku mereka bervariasi tergantung pada sejumlah faktor seperti kapasitas untuk replikasi dan stabilitas. Sebagai contoh, plasmid yang ditemukan dalam kelompok IncP-1 tidak hanya terbukti memiliki jangkauan host yang luas, tetapi juga frekuensi transfer yang tinggi.
Perbedaan dalam perilaku plasmid degradatif yang berbeda karenanya telah terbukti menghasilkan perilaku yang berbeda antara mereka dan host masing-masing.
- Penggunaan mikroorganisme biodegradatif untuk tujuan menghilangkan senyawa xenobiotik dari lingkungan yang terkontaminasi dikenal sebagai Bioaugmentation.
- Jika plasmid IncP-1 memiliki kisaran host yang luas, IncP-7 telah terbukti memiliki kisaran host yang sempit. Di sisi lain, IncP-9 memiliki kisaran host perantara.
Plasmid Kesuburan
Seperti banyak plasmid lainnya, plasmid kesuburan (F plasmid) memiliki struktur melingkar dan berukuran sekitar 100 kb.
Beberapa bagian utama dari F plasmid termasuk:
- Elemen transposable (IS2, 1S3, dan Tn1000)
- Situs replikasi (RepFIA, RepFIB, dan RepFIC)
- Asal transfer konjugatif (oirT)
- Daerah asal replikasi
F plasmid memainkan peran penting dalam reproduksi mengingat mereka mengandung gen yang memberi kode untuk produksi pilus seks serta enzim yang diperlukan untuk konjugasi.
F plasmid juga mengandung gen yang terlibat dalam transfer mereka sendiri. Karena itu, selama konjugasi, F plasmid meningkatkan transfer mereka sendiri dari satu sel ke sel lainnya.
Sedangkan sel-sel yang memproses F plasmid disebut sebagai donor, sel-sel yang kekurangan faktor ini adalah penerima. Di sisi lain, plasmid yang meningkatkan kemampuan sel inang untuk berperilaku seperti donor dikenal sebagai faktor transfer.
Selama konjugasi, sel donor (bakteri) dengan sex pili (1-3 sex pili) berikatan dengan protein spesifik pada membran luar penerima sehingga memulai proses kawin.
Setelah pengikatan awal, pili menarik kembali sehingga memungkinkan dua sel untuk mengikat bersama. Ini kemudian diikuti oleh transfer DNA dari donor ke penerima dan akibatnya transfer F plasmid. Akibatnya, penerima memperoleh faktor F dan memperoleh kemampuan untuk menghasilkan pilus seks yang terlibat dalam konjugasi.
Selama konjugasi, hanya DNA yang diteruskan dari donor ke penerima. Karena itu, sitoplasma dan bahan sel lainnya tidak ditransfer.
Pili kelamin adalah struktur kecil seperti batang yang memungkinkan sel-sel bakteri F-positif (sel yang memiliki faktor F) menempel pada F-negatif (sel-sel yang kekurangan pili) betina untuk mendorong transfer konjugatif.
Kol Plasmid
Plasmid kol memberi bakteri kemampuan untuk menghasilkan protein beracun yang dikenal sebagai colicine.
Bakteri seperti E. coli, Shigella dan Salmonella menggunakan racun plasmid ini untuk membunuh bakteri lain dan karenanya berkembang di lingkungan masing-masing.
Ada berbagai jenis col plasmid yang ada yang menghasilkan berbagai jenis colicines / colicins. Beberapa contoh plasmid Col termasuk Col B, Col E2 dan E3. Perbedaan mereka juga ditandai oleh perbedaan dalam mode tindakan plasmid.
Misalnya, sedangkan Kol B menyebabkan kerusakan pada membran sel bakteri lain (kekurangan plasmid) Kol E3 telah terbukti menginduksi degradasi asam nukleat sel target.
Seperti halnya plasmid kesuburan, beberapa plasmid Col telah terbukti membawa unsur-unsur yang meningkatkan transmisi mereka dari satu sel ke sel lainnya. Oleh karena itu, melalui konjugasi atau proses perkawinan, khususnya untuk sel dengan faktor F (fertilitas plasmid), Kol plasmid dapat ditransfer dari satu sel (donor) ke yang lain (penerima).
Akibatnya, penerima memperoleh kemampuan untuk menghasilkan racun yang membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri target yang kekurangan plasmid.
Plasmid Virulensi
Dibandingkan dengan bakteri tidak berbahaya lainnya, bakteri yang cenderung bersifat patogen secara alami membawa gen untuk faktor virulensi yang memungkinkan mereka untuk menyerang dan menginfeksi inang masing-masing.
Untuk beberapa bakteri ini, faktor virulensi plasmid adalah hasil dari materi genetik organisme itu sendiri. Namun, bagi yang lain, ini adalah sebagai akibat dari elemen genetik dari DNA ekstra-kromosom. Meskipun ada sumber lain dari elemen tersebut, mis. transposon, plasmid adalah beberapa elemen genetik seluler yang paling umum.
Sehubungan dengan patogenisitas, plasmid virulensi memainkan peran penting mengingat mereka dapat membantu bakteri beradaptasi secara efektif dengan lingkungan masing-masing.
Ini karena plasmid virulensi dapat memungkinkan organisme untuk mengekspresikan berbagai fungsi terkait virulensi sehingga memberikan organisme dengan karakteristik yang lebih menguntungkan untuk berkembang di lingkungan mereka.
Seperti jenis plasmid lainnya, plasmid virulensi juga dapat ditularkan dari satu bakteri ke bakteri lain. Selain gen virulensi, plasmid juga terbukti membawa unsur-unsur penting lainnya yang meningkatkan transmisi dan pemeliharaan.
Karena alasan ini, ukuran plasmid ini lebih besar tetapi jumlahnya rendah. Ini memastikan plasmid mereka tidak menyebabkan beban tambahan bagi organisme selama pembelahan sel.
Biasanya, pembelahan sel dan pemeliharaan sel membutuhkan penggunaan energi. Dengan memiliki jumlah plasmid virulensi yang rendah, sel-sel terhindar dari beban metabolisme yang signifikan yang akan diperlukan untuk pemeliharaan dan duplikasi genom dari banyak plasmid.
Beberapa jenis lain dari plasmid termasuk:
- Plasmid rekombinan – Plasmid yang telah diubah di laboratorium dan dimasukkan ke dalam bakteri untuk keperluan studi
- Crptic plasmid – Tidak ada fungsi yang diketahui
- Plasmid metabolik – Meningkatkan metabolisme inang
- Plasmid konjugatif – Mempromosikan pemindahan diri
- Plasmid bunuh diri – Gagal meniru saat ditransfer dari satu sel ke sel lainnya
Vektor Plasmid
Vektor mengacu pada bagian mana pun dari molekul yang mengandung bahan genetik yang dapat direplikasi dan diekspresikan ketika ditransfer ke sel lain. Berdasarkan definisi ini, dimungkinkan untuk melihat mengapa kata “vektor” dan “plasmid” kadang-kadang dipertukarkan. Namun, ini bukan untuk mengatakan bahwa semua plasmid adalah vektor.
Salah satu karakteristik utama vektor plasmid adalah ukurannya kecil. Terlepas dari ukurannya, Vektor Plasmid dicirikan oleh asal replikasi, penanda selektif serta beberapa situs kloning.
Vektor plasmid yang ideal memiliki nomor salinan yang tinggi di dalam sel. Dengan demikian, ini memastikan jumlah gen target yang tinggi untuk keperluan kloning. Ini juga memastikan bahwa gen yang diminati meningkat selama pembelahan genomik. Selain itu, plasmid dapat memiliki gen penanda sebagai penanda visual untuk membantu menentukan apakah kloning berhasil.
Karena beberapa situs kloning, plasmid telah terbukti menjadi beberapa vektor terbaik untuk kloning. Karena karakteristik ini, dimungkinkan bagi enzim restriksi untuk membelah berbagai daerah plasmid untuk kloning.
Selama bertahun-tahun, menggunakan vektor-vektor ini memungkinkan DNA rekombinan untuk dimasukkan ke dalam sel inang untuk tujuan penelitian. Sebagai contoh, melalui jenis kloning ini, menjadi mungkin bagi para peneliti untuk mengurutkan genom berbagai spesies, mempelajari ekspresi gen dan bahkan mengamati berbagai mekanisme seluler.
Sementara plasmid yang lebih kecil mampu membawa segmen DNA yang panjang, ukuran yang berkurang juga dapat membantu menghilangkan gen yang tidak esensial yang tidak diperlukan untuk kloning.
Bagaimana sebuah plasmid dibangun di laboratorium?
Karena sifat buatannya, plasmid lab biasanya disebut sebagai “vektor” atau “konstruksi”. Untuk memasukkan gen yang diinginkan ke dalam vektor, para ilmuwan dapat menggunakan salah satu dari berbagai metode kloning (Enzim restriksi, independen Ligasi, Gateway, Gibson, dll).
Metode kloning pada akhirnya dipilih berdasarkan pada plasmid yang ingin Anda tiru. Apapun, setelah langkah-langkah kloning selesai, vektor yang mengandung gen yang baru dimasukkan diubah menjadi sel-sel bakteri dan secara selektif ditanam di piring antibiotik.
Bagaimana para ilmuwan menggunakan plasmid?
Secara umum, para ilmuwan menggunakan plasmid untuk memanipulasi ekspresi gen dalam sel target. Karakteristik seperti fleksibilitas, keamanan, dan efektivitas biaya memungkinkan ahli biologi molekuler untuk secara luas memanfaatkan plasmid di berbagai aplikasi.
Beberapa jenis plasmid yang umum meliputi: Kloning plasmid, Plasmid ekspresi, Plasmid knock-down gen, Plasmid reporter, Plasmid virus, dan plasmid rekayasa Genom.
Sampai saat ini, para ilmuwan di seluruh dunia secara luas menggunakan vektor-vektor ini untuk percobaan yang meliputi pencitraan fluoresens, teknologi DNA rekombinan, produksi protein massal, pemodelan penyakit, penemuan obat, dan pengeditan genom (hanya untuk beberapa nama).
Sifat Plasmid,
Plasmid adalah bentangan DNA yang mengandung setidaknya satu gen dan sifat berikut:
- Plasmid itu kecil (sehubungan dengan hampir semua genom)
- Plasmid bersifat ekstrakromsomal (tidak dikemas di dalam kromosom)
- Plasmid merupakan edaran (Tidak ada perbedaan 5 ‘atau 3 mulai atau berakhir)
- Plasmid mampu replikasi otonom (mis. Mereka mengandung asal replikasi sendiri)
Plasmid muncul secara alami pada banyak prokariota, dan seringkali mengandung gen kritis yang diperlukan untuk resistensi antibiotik, tetapi mereka juga umumnya diadopsi untuk dikooptasi untuk digunakan dalam ilmu kehidupan sebagai vektor.
Dalam biologi molekuler, vektor adalah molekul DNA yang digunakan untuk transfer gen horizontal (yaitu untuk membawa materi genetik dari satu sel ke sel lain untuk keperluan replikasi atau ekspresi).
Vektor Kloning:
Dalam biologi molekuler, plasmid digunakan sebagai vektor, mengangkut bahan genetik dari satu sel ke sel lain, untuk keperluan replikasi atau ekspresi.
Salah satu kegunaan yang paling sering untuk plasmid adalah sebagai “vektor kloning”. Vektor kloning digunakan untuk mereplikasi, memodifikasi, dan menyimpan sementara urutan gen tertentu yang diinginkan.
Plasmid yang digunakan sebagai vektor kloning biasanya mengandung:
- Situs kloning ganda (MCS), berisi sekuens yang dikenali oleh enzim restriksi umum, dan dirancang untuk memungkinkan penyisipan sederhana dari sekuens gen yang diinginkan.
- Sebuah asal replikasi (ORI), yang memungkinkan plasmid untuk secara sederhana dan cepat diduplikasi oleh mesin replikasi organisme inang.
- Gen yang mengkode produk akhir yang menyampaikan beberapa bentuk resistensi antibiotik ke organisme inang (ini memungkinkan peneliti untuk membedakan antara bakteri yang mengandung plasmid, dan yang tidak).
Mekanisme seleksi yang dirancang untuk mengonfirmasi bahwa urutan yang diinginkan telah dimasukkan ke dalam beberapa situs kloning.
Setelah semua kloning yang diperlukan telah selesai, vektor kloning ditransfer ke organisme inang yang kuat (paling sering strain laboratorium E. coli) melalui teknik yang dikenal sebagai transformasi.
E. coli yang telah ditransformasi akan mereplikasi vektor kloning, dengan masing-masing sel bakteri menghasilkan ratusan atau bahkan ribuan salinan dalam waktu yang sangat singkat. Setelah lisis, vektor kloning salinan tinggi dapat diisolasi, dimodifikasi lebih lanjut, atau dipindahkan ke vektor ekspresi.
Keterbatasan Plasmid
Plasmid adalah alat yang ampuh, tetapi terbatas. Keterbatasan yang paling sering dijumpai adalah ukuran.
Plasmid ideal untuk membawa sejumlah kecil bahan genetik, tetapi pengiriman dan fungsinya sangat terhambat ketika sekuens yang lebih besar (di atas ~ 15 kb) digunakan.
Dalam hal ini, metode alternatif seperti kosmid atau kromosom buatan bakteri (BAC) adalah pilihan yang lebih baik karena mengandung urutan yang memfasilitasi pengemasan DNA yang efisien.
